实践目的：对肝损伤小鼠开展血清 TC、TG、HDL、LDL 检测的实践目的，核心是通过血脂相关指标的变化，表征肝损伤状态下肝脏脂质代谢的异常程度，明确肝损伤对脂质合成、转运、分解的影响
1.精准定量检测
通过对应的酶法（如 COD-PAP 法、GPO-PAP 法），分别精确测定生物样本（血清、血浆、细胞 / 组织匀浆等）中总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量。
2.建立实验操作规范
掌握各类样本（血清、培养上清、组织 / 细胞匀浆）的前处理流程，以及 96 孔板的标准化加样、孵育、比色操作，建立稳定、可重复的实验操作体系。
3.数据处理与结果分析
学会利用吸光度值，结合标准品浓度、蛋白浓度或样本量等参数，通过对应公式计算出样本中各脂质指标的浓度，并能对结果进行初步分析与解读。
实践内容：本次实验均采用96 孔板比色法，以血清 / 血浆、细胞 / 组织匀浆为检测样本，核心依托 COD-PAP 法（总胆固醇 / 低密度 / 高密度）、GPO-PAP 法（甘油三酯）的酶促显色反应，通过酶标仪检测吸光度，结合标准曲线计算样本浓度，操作流程高度标准化，四指标检测操作框架一致，仅部分试剂细节有差异
一、实验前准备
1. 器具与耗材准备
提前准备校准合格的单道 / 多道移液枪（10μL、50μL、100μL、200μL）、一次性无菌吸头、适配酶标仪的透明 96 孔比色板、封板膜、涡旋混匀仪、恒温孵育箱（37℃）、酶标仪、冰盒、离心管（1.5mL）；所有非一次性器具提前灭菌烘干，避免污染。
2. 试剂与样本准备
试剂恢复：将检测试剂盒中的标准品、工作液（底物缓冲液 + 酶试剂混合液）、空白液从冷藏 / 冷冻环境取出，除特殊说明外，置于室温平衡 15-20min，涡旋轻轻混匀（避免剧烈震荡产生气泡），确认无未溶颗粒后备用；
标准品梯度配制：取 1.5mL 离心管，按试剂盒说明书将标准品用空白液进行倍比梯度稀释（通常为 5-6 个梯度，含空白孔浓度 0），配制后轻轻混匀，静置 5min 备用，每批次实验需新鲜配制标准曲线；
样本预处理：
血清 / 血浆：新鲜样本室温静置 30min 后，3000r/min 离心 10min，取上层澄清血清 / 血浆；冻存样本 4℃解冻，涡旋混匀，无沉淀即可使用，若有沉淀需再次低速离心去除；
细胞 / 组织匀浆：匀浆后 4℃、8000-10000r/min 离心 10min，取上清液；若样本浓度过高，按试剂盒要求用空白液进行精准稀释（记录稀释比例），冰浴保存备用；
3. 仪器预热
提前开启37℃恒温孵育箱和酶标仪，酶标仪预热 30min，同时设置后续检测的波长参数（T-CHO/TG/LDL-C/HDL-C 通常主波长 500-550nm，副波长 600-650nm，严格按试剂盒要求设定）
二、96 孔板加样操作
1. 孔板布局规划
提前在实验记录本上绘制 96 孔板布局图，明确空白孔、标准品梯度孔、样本孔、复孔位置：空白孔设 2 个平行，标准品梯度每浓度设 2 个平行，样本每例设 2-3 个平行；同组孔位相邻排列，避免读数错位。
2. 加样顺序与量（通用配比，具体按试剂盒说明书调整，精准度 ±1μL）
加样遵循“先加空白液 / 标准品 / 样本，后加工作液”的顺序，吸头一次性使用，加样时枪头垂直悬空于孔板上方，避免触碰孔壁和液面，防止挂壁导致体积误差，具体加样量参考：
3. 加样操作细节
空白孔：先加入规定量空白液，作为吸光度检测的基线参照；
标准品孔：从低浓度到高浓度依次加样，每换一个浓度更换吸头，避免高浓度污染低浓度；
样本孔：按编号依次加样，样本间更换吸头，若样本有稀释，需在布局图上标注稀释比例；
工作液加样：加完所有空白液、标准品、样本后，快速向所有孔中加入酶促工作液，可使用多道移液枪提高效率，保证各孔加样时间差不超过 5min，避免反应不同步。
三、混匀与孵育操作
封板与混匀：所有孔加样完成后，立即用封板膜紧密密封孔板（防止液体挥发和污染），将孔板置于涡旋混匀仪上，调 ** 低速（500-800r/min）** 混匀 10-15s，或用手轻拍孔板侧壁混匀，避免剧烈震荡产生气泡；若孔内有气泡，可用枪头轻轻弹除，不可戳破（气泡会导致吸光度读数偏低）；
恒温孵育：将密封好的孔板放入37℃恒温孵育箱，孵育时间严格按试剂盒要求（T-CHO/TG 通常 15-20min，LDL-C/HDL-C 通常 20-30min，不可缩短或延长），孵育过程中保持孵育箱门关闭，保证箱内温度均匀。
四、酶标仪比色检测操作
取出孔板：孵育时间到后，立即取出孔板，撕去封板膜，用无尘纸 / 吸水纸轻轻擦拭孔板外壁，彻底擦除水渍、污渍、指纹（外壁杂质会影响光的透过，导致读数误差）；
放置孔板：将孔板平稳放入酶标仪的样品槽中，确认孔板与卡槽对齐，避免位置偏移；
启动检测：在酶标仪操作界面选择已设定的波长参数，点击 “开始检测”，仪器将自动读取每孔的吸光度值（OD 值），并自动记录数据；
数据导出：检测完成后，将吸光度数据导出至电脑，保存为 Excel 格式，便于后续处理；
关键注意：孵育完成后30min 内完成比色，避免显色反应褪去或背景值升高，导致结果偏差。
五、实验后清理与器具归位
孔板处理：检测后的 96 孔板属于生物实验废料，按生物安全要求放入专用医疗废物袋，集中处理，不可随意丢弃；
器具清洗：移液枪用无尘纸擦拭干净，调回最大量程后归位；离心管、烧杯等器具用去离子水清洗后，灭菌烘干备用；
试剂保存：未使用的标准品、工作液按试剂盒要求重新冷藏 / 冷冻保存，复溶后的试剂做好标记，在有效期内使用；
仪器关机：关闭酶标仪和恒温孵育箱，清理仪器操作台，做好仪器使用记录；
环境整理：清理实验台，用 75% 酒精擦拭操作台，实验废液按分类要求倒入专用废液桶，做好实验全程记录（含试剂批号、孵育条件、酶标仪型号、加样量、稀释比例等）。
六、特殊操作说明（LDL-C/HDL-C 专属步骤）
LDL-C 和 HDL-C 检测在上述基础流程上，增加 “沉淀剂处理” 步骤（去除干扰脂蛋白），具体为：
样本预处理阶段：取血清 / 血浆 / 匀浆上清与试剂盒配套的脂蛋白沉淀剂按比例混合（通常 1:1 或 2:1），涡旋混匀后，室温静置 10-15min；
离心除杂：4℃、3000r/min 离心 10min，取上层澄清液作为待测样本液，后续加样、孵育、比色操作与 T-CHO/TG 一致；
实践结果：
实践总结：本次脂质指标（T-CHO/TG/LDL-C/HDL-C）酶法检测实践，通过标准化的实验流程，从样本预处理、试剂配制、96 孔板精准加样、恒温孵育到酶标仪比色检测，成功实现了对血清、血浆及细胞 / 组织匀浆样本中四项核心脂质指标的定量分析，不仅熟练掌握了 COD-PAP 与 GPO-PAP 酶促显色检测的关键技术，建立了稳定可重复的实验操作体系，还通过严谨的数据处理与分析获取了可靠的脂质代谢水平数据，为后续科研项目提供了有力支撑；实践中既锤炼了精准操作、问题排查的实验技能，也深化了对脂质代谢检测原理与科研严谨性的认知，同时针对加样一致性、沉淀效果等环节的不足提出了改进方向，为未来拓展检测场景、提升实验精度奠定了坚实基础。
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